Как устроен процесс выделения ДНК в лаборатории

ДНК — это длинная молекула с отрицательным зарядом: она кодирует инструкцию по сборке отдельных белков, клеток, тканей и целых организмов. ДНК содержится во всех клетках за редкими исключениями: например, зрелые эритроциты млекопитающих теряют ядро с генетическим материалом, чтобы лучше переносить кислород. Поэтому выделить ДНК можно из любой ткани живого или мертвого организма — вопрос только в том, сколько усилий придется затратить.

Сотрудники лаборатории Genotek успешно справлялись с иголками сосны, стволовыми клетками, йогуртами, зародышами лягушек, сердцами мышей и золотистым стафилококком, а автор этой статьи на студенческом практикуме выделяла ДНК из консервированной кукурузы. Но чаще всего источником генетического материала для анализа становится кровь или слюна человека.

Обработка биоматериала и выделение ДНК — это первый этап молекулярно-биологического исследования. Генетический материал хранится в ядрах клеток, которые нужно разрушить, иначе ДНК не выйдет в раствор и будет недоступна для анализа. Из клеток животных часть ДНК можно высвободить простым нагреванием, а вот с клетками растений это не пройдет: они защищены прочной клеточной стенкой из целлюлозы.

Чтобы анализ прошел успешно, важно очистить ДНК от примесей. Примеси ингибируют активность ферментов, которые нужны для подготовки образка к анализу на секвенаторе или чиповом анализаторе.

Самые распространенные ингибиторы в биологических тканях — это гем (компонент эритроцитов, который позволяет им переносить кислород), коллаген в костях и других соединительных тканях, меланин в волосах и коже, ароматические соединения в растительных образцах, миоглобин в тканях мыщц (1, 2). В слюне анализу мешают остатки пищи и консервант, который используется для хранения и перевозки образца: он содержит SDS, ингибирующий работу ферментов. При перевозке SDS защищает ДНК от разрушения, но при попадании в реакционную смесь нарушает работу ДНК-полимеразы.

Открыл ДНК швейцарский врач Фридрих Мишер, когда изучал лейкоциты из гноя на хирургических повязках. В 1869 году Мишер заметил, что при выделении белков из лейкоцитов в осадок выпадает вещество с кислотными свойствами, которое он назвал «нуклеином». Позднее Мишер использовал для получения нуклеина молоки лососевых рыб, которых собственноручно ловил в Рейне, и писал о роли вещества в оплодотворении. Однако роль ДНК в передаче наследственной информации еще долго не замечали: ученые считали, что она слишком просто устроена для вещества, в котором записаны наследственные признаки. Только через 83 года генетическую роль нуклеиновой кислоты установили исследователи Херши и Чейз.

В лаборатории Genotek выделение ДНК полностью автоматизировано: робот не ошибается и не устает. Процесс выделения происходит в несколько шагов:

• Разрушаем мембраны клеток и клеточных ядер, чтобы все содержимое клетки — ДНК, белки, липиды и сахара — вышло в раствор. Для этого используем лизисный буфер с детергентом SDS (для слюны) или тиоцианатом гуанидина (для крови). Детергент разрушает мембраны, а буферный компонент раствора поддерживает pH на оптимальном для ДНК уровне. Лаурилсульфат натрия (SDS) входит в состав обычного шампуня, а вот тиоцианат гуанина токсичен и вызывает щелочные ожоги при попадании на кожу. Его агрессивные денатурирующие свойства используют при изучении испанского гриппа: инактивированные вирусные частицы становятся безопасными для исследователей.
  
  
• Избавляемся от белков. Вышедшую в раствор ДНК нужно освободить от связанных с ней белков. Одновременно с этим необходимо инактивировать ДНКазы — ферменты, которые атакуют «оголенную» ДНК. За разрушение клеточных белков отвечает еще один компонент лизисного буфера — протеина К, фермент, который получают из микроскопических грибов рода Engyodontium album.Буква К в названии указывает на способность расщеплять кератин, белок ногтей и волос.
  
  
• Отделяем ДНК от примесей. Центрифугируем раствор в пробирках с кремниевой мембраной, которая связывается с ДНК и пропускает остальные органические компоненты клетки. Центрифугирование многократно увеличивает скорость фильтрации сквозь мембрану. Мембрану со связанной ДНК несколько раз промывают спиртом — изопропанолом или этанолом.
  
  
• Растворяем ДНК в буфере для хранения. Связанную с мембраной ДНК отмывают буфером для элюции (элюцией называют процесс выведения в раствор адсорбированного вещества). Растворенная в буфере ДНК может храниться при −20°С в течение нескольких лет

При неправильном сборе, некорректном или слишком долгом хранении биологических образцов ДНК в клетках разрушается. Такие образцы подходят для анализа небольших фрагментов генома (например, при установлении отцовства), но непригодны для исследований, где важно прочитать всю генетическую последовательность (секвенирование) или проанализировать одновременно сотни тысяч нуклеотидов в разных участках ДНК (генотипирование на микрочипах).

Отсутствие деградации геномной ДНК проверяют электрофорезом в агарозном геле. Под действием тока отрицательно заряженные молекулы ДНК движутся к аноду со скоростью, пропорциональной их размеру. Геномная ДНК хорошего качества выглядит на форезе четкой полоской, а некачественная ДНК «шмерит» — формирует градиент из фрагментов разных длин. Такой образец нельзя брать на анализ.

Важно, чтобы ДНК не разрушилась при перевозке и хранении биообразца. Для этого в пробирку добавляют консервант. Если слюны больше, чем требуется, консервант не сработает. Если слюны мало, ДНК не хватит для анализа. Поэтому все поступившие в лабораторию пробирки оценивают визуально и в случае проблем сразу отправляют на перезабор.

Иногда не получается выделить качественную ДНК из внешне пригодного образца. Тогда лаборатория делает вторую попытку, используя оставшуюся порцию слюны, чтобы исключить технические ошибки. Если она тоже оказывается неудачной, мы приглашаем клиента на перезабор и просит внимательно соблюдать правила сдачи биоматериала: важно, чтобы в слюне оказалось достаточно клеток эпителия щек и не было посторонних примесей.

К сожалению, в слюне некоторых людей от природы содержится слишком мало ДНК. Поэтому, если на «пересдаче» человек проваливается, мы предлагаем ему сдать кровь.

ДНК, прошедшую контроль качества, направляют на секвенирование или генотипирование на микрочипах.